CancerCell急性髓系白血病

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年7月12日，来自美国俄勒冈健康与科学大学ElieTraer团队Joshi等人在CancerCell杂志上发表了题为“TheAMLmicroenvironmentcatalyzesastepwiseevolutiontogilteritinibresistance”的文章，采用综合性的方法来研究从早期到晚期耐药性的演变、探索其耐药机制及影响因素，并证实AURKB对早期耐药性至关重要，研究建立的逐步、非随机的吉瑞替尼耐药性模型概括了临床耐药性，并为解释耐药性的演变提供了一个新的框架，提出了一些克服耐药性的治疗策略。

撰文

李佳乐

Highlights

1.逐步的从早期到晚期的吉瑞替尼耐药的模型概括了人类疾病；

2.骨髓微环境中早期耐药细胞依赖AURKB恢复生长；

3.先前存在的NRAS突变在晚期耐药中扩大并导致复发；

4.代谢重编程在吉瑞替尼耐药的进化过程中发生。

Summary

文章研究详细介绍了FLT3突变的急性髓系白血病（AML）中吉瑞替尼耐药性的逐步演变。早期耐药是由骨髓微环境介导的，骨髓微环境保护了残留的白血病细胞。随着时间的推移，白血病细胞进化出内在的耐药机制，即晚期耐药机制。文章通过整合全外显子组测序、CRISPR-Cas9、代谢组学、蛋白质组学和药理学等多种方法从机理上定义了早期和晚期耐药。早期耐药细胞经历代谢重编程，生长较慢，并依赖于极光激酶B（AURKB）。晚期耐药细胞的特征是先前存在的NRAS突变亚克隆的扩增和持续的代谢重编程。研究人员的模型很好地反映了使用吉瑞替尼治疗的AML患者的时间和突变。AURKB的药理学抑制使早期耐药细胞培养物和使用吉瑞替尼治疗的AML患者的原发性白血病细胞重新敏感。这些发现支持了一种联合治疗策略，即在已有耐药突变扩大之前，用AURKB抑制剂和吉瑞替尼药物同时靶向作用于早期耐药的AML细胞。

Introduction

急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性血液系统恶性肿瘤，严重影响老年人。其特征是未成熟成髓细胞异常增殖，浸润骨髓并损害正常造血。fms相关受体酪氨酸激酶3（FLT3）的基因驱动突变是AML中最常见的，并且发生在所有患者中的比例超过30%。FLT3突变主要由受体旁膜结构域内的内部串联重复（ITD）事件和酪氨酸激酶结构域（TKD）的点突变组成，导致组成性FLT3激活、促存活下游信号和白血病细胞的扩增。FLT3-ITD突变与复发风险增加相关，为几代FLT3抑制剂（FLT3i）的开发提供了动力。

尽管FLT3i能迅速清除循环中的外周白血病细胞，但残留的AML细胞仍存在于骨髓微环境中，其生存和扩张导致疾病复发。重要的是，残留细胞依赖AML微环境中的生长因子和细胞因子生存，这导致早期抗药性，也称为疾病持续性。由于可供研究的残余细胞数量很少，对其生物学和维持其存活的机制了解甚少。因此，耐药最常在复发后研究，研究人员称之为晚期耐药，通常由耐药突变来定义。尽管其中一些突变可以通过成熟的体外诱变和转化分析进行预测，但对培育早期和晚期的耐药性进化适应机制的基本理解尚未得到彻底研究。

吉瑞替尼是一种有效的FLT3i，最近被FDA批准用于复发或难治性的AML。在本研究中，研究人员通过整合全外显子组测序（WES）、CRISPR-Cas9筛选、代谢组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和小分子抑制剂筛选，全面分析了早期至晚期吉瑞替尼耐药性的时间演变。为模拟微环境驱动的耐药性，AML细胞与通常由骨髓基质细胞分泌的外源性保护蛋白一起培养，这促进了配体依赖的早期耐药性。去除这些配体可暂时恢复对吉瑞替尼的敏感性，但最终仍会导致晚期耐药性中激活的内在突变的扩大。多重正交方法表明，晚期对吉瑞替尼的耐药性主要由NRAS激活突变的克隆选择和下游MAPK信号的过度激活驱动，这与复发使用吉瑞替尼的患者一致。相反，早期抗性并不依赖于NRAS信号，而是表现为代谢重编程、生长缓慢和依赖于极光激酶B信号（AURKB）。这些实验观察结果在接受吉瑞替尼治疗的急性髓系白血病患者样本中得到证实，该样本显示细胞生长缓慢，代谢改变，对吉瑞替尼和AURKB抑制的联合作用极为敏感。研究人员的方法提供了一种了解早期和晚期耐药的AML细胞独特生物学的方法，以及开发了新的早期耐药组合方法，以阻止晚期耐药突变的扩展。

Results

1、微环境因素促进早期吉瑞替尼耐药性的发展

研究人员用外源性成纤维细胞生长因子2（FGF2）和FLT3配体（FL）来模拟微环境对吉瑞替尼耐药的保护。这些蛋白质由骨髓基质细胞分泌，能保护FLT3AML细胞系和原代AML细胞免受多种FLT3i的侵袭。研究人员用浓度增加的吉瑞替尼（0–nM）±10ng/mL的FGF2或FL处理MOLM14细胞（人AMLFLT3-ITD+细胞系）72小时（图1A）。在这项短期试验中，FGF2和FL都提供了对耐吉瑞替尼的保护。为了模拟在患者的保护性骨髓微环境中长期暴露吉瑞替尼，研究人员分别用添加了nM吉瑞替尼、仅含培养基（4例）和分别添加了10ng/mLFGF2或FL的培养基（分别4例）来连续培养MOLM14。用不含保护性配体的吉瑞替尼处理过的MOLM14亲本细胞无法恢复生长（图1B，黄线）。而所有补充了FGF2或FL的培养物最终都恢复了生长，突出了外源性生存因子在促进早期吉瑞特替尼抗性方面的重要性（图1B，青绿色和褐红色实线）。用配体处理大约4个月后，研究人员通过去除FGF2和FL对早期耐药培养物施加选择性压力。虽然这暂时恢复了对吉瑞替尼的敏感性，但培养物最终恢复指数增长，演变为非配体依赖性增长和晚期耐药（图1B，虚线）。对配体依赖性早期耐药培养中FLT3、MAPK和PI3K/AKT通路的免疫印迹分析表明，FL部分恢复了FLT3活性，而FGF2通过激活FGFR1重新激活了MAPK和AKT（图1C和1D）。相反，在晚期耐药配体非依赖性培养中，FLT3本身仍然不活跃，但下游MAPK和PI3K/AKT信号明显激活（图1C和1D）。研究人员还用人AMLFLT3-ITD+细胞系MV4建立了一个同等的吉瑞替尼耐药模型；并在第二个独立模型中发现了类似的双相耐药模式。为了解早期和晚期吉瑞替尼耐药的机制，采用了五种不同但互补的方法：WES、全基因组CRISPR-Cas9筛选、代谢组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学以及小分子抑制剂筛选（图1E）。

图1早期和晚期吉瑞替尼耐药菌株的出现

2、NRAS突变在晚期抗性中其重要作用，但在早期抗性中不是必需的。

研究人员对晚期对吉瑞替尼耐药的MOLM14和MV-4-11的培养物进行了WES分析，发现尽管突变并不总是相同的，但15种培养物中有13种存在激活的NRAS点突变（图2A和S1B）。晚期耐药培养物具有FLT3FL门控开关突变，也表明突变会促进对吉瑞替尼及其他FLT3i的耐药性。在其他三种培养物中，研究人员检测到一种新的FLT3NK突变，该突变也以类似FL的方式导致对吉瑞替尼的耐药性。WES分析检测到的所有在晚期吉瑞替尼耐药培养中检测到的突变都通过Sanger测序（图2B和S1C）得到确认，并通过Pindel软件确认了FLT3-ITD+状态。然后研究人员评估了这些突变在长期培养过程中出现的时间。通过Sanger测序，在MOLM14培养物中存在配体的情况下，突变在长达4个月内无法被检测到（图2B）；然而5个月后，在早期耐药的MV-4-11培养物中可以检测到突变，这表明该细胞系的早期和晚期耐药之间有更多的重叠。

为了验证MOLM14耐吉瑞替尼模型中低水平的NRAS突变是预先存在的还是从头发生的，研究人员优化了液滴式数字PCR（ddPCR）分析，以量化NRASG12S和G12D的变异等位基因频率（VAF）。ddPCR的高灵敏度使研究人员能够在MOLM14亲代细胞中以非常低的水平检测NRASG12S/D（0.1%），这表明这些突变不是从头发生的。VAF在早期抗性培养中略有增加（0.15%），在后期抗性培养中一旦去掉保护性配体，VAF就会迅速扩大（图2C）。这些数据表明，在配体存在的情况下，NRAS突变不是必需的，但当配体被移除时，NRAS突变成为显性突变。鉴于这一假设，研究人员测试了在缺乏配体的情况下，NRAS突变是否足以驱动吉瑞替尼的耐药性。研究人员在MOLM14细胞中稳定表达了NRASWT和NRASG12S/D突变，并检测了它们对吉瑞替尼的敏感性。在没有吉瑞替尼的情况下，研究人员观察到NRAS突变细胞系与MOLM14亲本细胞和NRASWT细胞相比在细胞增殖方面没有差异（图2D）。1周后，用mM的吉瑞替尼处理会显著抑制对照组和NRAS突变细胞系的生长（图2E和2F），这表明仅有NRAS突变不足以立即产生耐药性。最终，用NRASG12S或NRASG12D处理的MOLM14细胞在没有配体存在的情况下对吉瑞替尼产生了抗性（图2E和2F，虚线）。然而，用FGF2或FL培养这些细胞显著加速了耐药性的产生，强调了即使在NRAS突变存在的情况下，微环境也能催化抗药性的发展（图2E和2F，实线）。

图2NRAS突变在抗药性晚期富集而非抗药性早期

3、全基因组CRISPR-Cas9筛选揭示了早期抗药性比晚期抗药性更复杂

为了从基因上研究驱动抗性的信号通路，研究人员在有代表性的FGF2和FL早期和晚期抗性MOLM14培养物中进行了全基因组CRISPR-Cas9再敏化筛选（图3A）。CRISPR-Cas9对依赖于FGF2和FL的培养物的分析没有发现与早期吉瑞替尼耐药有关的单个基因，而是揭示了参与细胞周期进展、脂质代谢和PI3K/MAPK信号通路的大量基因（图3B、S2和S3；表S5），强调了早期耐药性的多方面特征。

与早期抗药性相比，NRAS在晚期抗药性培养中的影响最为显著（图3C）。用元分析方法比较排序基因列表和稳健排序整合法，证实了FGF2和FL晚期抗性筛选之间存在重叠，并发现NRAS（错误率0.）是晚期吉瑞替尼抗性的主要调节因子（图3C）。经验证，CRISPR-Cas9缺失的NRAS在两种晚期耐药培养中都部分恢复了对吉瑞替尼的敏感性，这显示出对NRAS/MAPK信号的强烈依赖以维持生存（图3D）。WES和CRISPR-Cas9筛选（图3E）发现NRAS依赖性的一致性促使研究人员测试下游MAPK和PI3K/AKT信号通路（图3F）的小分子抑制剂。两种MEK抑制剂selumetinib和trametinib及一种PIK3CA抑制剂taselisib，也能部分恢复对吉瑞替尼的敏感性（图3G-3J和S3K；表S2），这强调了NRAS信号在后期抗性中的重要性。

图3早期吉瑞替尼耐药性是多因素的，而晚期耐药性则表现出对NRA的依赖性

4、代谢重编程从早期抗性开始，持续到晚期抗性

FGF2和FL早期CRISPR-Cas9筛选的多个靶点提示了代谢紊乱可能导致早期抗性（图3B和4A），为整体代谢谱分析提供了理论基础。吉瑞替尼处理MOLM14亲本细胞48小时，与未经处理的细胞（每个4例）相比，表明吉瑞替尼能迅速降低中枢能量代谢并改变甘油磷脂代谢（表S3）。加入FGF2或FL超过48h后，这些效应仅被适度减弱。然而，对早期和晚期吉特利替尼耐药培养物（每组4例）的代谢物检测表明，长期抑制FLT3会导致大范围的代谢组重新编程（图4B）。偏最小二乘判别分析显示，早期和晚期抗吉瑞替尼的MOLM14培养物的代谢组与亲代细胞相比存在显著差异（图4C）。与FGF2早期耐药细胞的CRISPR-Cas9筛选结果一致（图4A），这些细胞的代谢谱证实了相对于MOLM14亲代细胞，鞘脂/磷脂代谢物增加的趋势。与亲代相比，FGF2晚期金霉素抗性细胞中1-磷酸鞘氨醇（p=0.）、1-磷酸鞘氨醇（p=0.）和磷酸乙醇胺（p0.）显著富集，这些变化在晚期抗性中变得更为显著（图4D；表S3）。所有代谢物比较均经Sidak校正。结合CRISPR-Cas9验证实验（图S4A），这些数据表明FGF2早期耐药细胞对鞘脂/磷脂代谢的初始依赖性，在晚期耐药细胞中变得更加突出。

另一方面，FL衍生的抗吉瑞替尼培养物显示脂肪酸/肉碱代谢增加。FL早期细胞（每组4例）中的酰基卡尼汀水平与未经处理的亲代细胞相似，但在FL晚期耐药细胞（每组4例；图4E；表S3）。为评估FL早期和晚期培养中脂肪酸分解代谢的功能相关性，研究人员用海马分析法测量了氧化磷酸化（OXPHOS）活性的变化（图4G-I）。在FL耐药培养后期，给予肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1）抑制剂依托莫西（ETO）（图4F）对氧磷的影响最大（图4I，降低FCCP和鱼藤酮/抗霉素A虚线之间的最大呼吸）。这表明，尽管葡萄糖含量丰富，但能量依赖于酰基肌醇。CPT1A和CPT2的CRISPR-Cas9失活（图S4B和S4C）也增加了FL早期和晚期耐药培养中对吉瑞替尼的敏感性，进一步对FL衍生培养中对肉碱代谢的依赖性提供了支持。

图4早期和晚期耐吉瑞替尼细胞表现出独特的代谢依赖性

5、不同的蛋白质组定义了早期和晚期抗吉瑞替尼的耐药细胞

为进一步确定早期抗性，研究人员进行了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的研究。利用基于等压标记的综合分析方法，对亲代、早期和晚期吉替替尼耐药的MOLM14和MV-4-11细胞的蛋白质裂解产物（每组4例）进行了质谱分析，共鉴定出个蛋白质和36,个磷酸肽（图5A）。类似于它们的代谢谱（图4C），主成分分析（PCA）可视化显示MOLM14亲本、早期抗性和晚期抗性培养物之间存在明显的分离，以及配体的明显聚类（图5B）。抗吉瑞替尼的MV-4-11细胞的蛋白质组和磷酸化蛋白质组在早期和晚期耐药之间显示出相似的差异，但差异不像MOLM14模型中那样明显，这可能与配体补充过程中较早出现NRAS突变相对应（图S5A和S1C）。

对于初始分析，同时分析FGF2和FL早期和晚期耐药的MOLM14培养物（每组8例）。由于磷酸化调节多种细胞过程，激酶底物富集分析（KSEA）用于通过评估对其各自底物的磷酸化水平的修饰来推断激酶活性的变化。在早期对吉瑞替尼耐药的MOLM14细胞中，KSEA显示促进细胞周期进展的蛋白质活性显著降低（p0.05）（CDK1、2、4、5、6、7和9；图5C），以及细胞周期检查点（PRKCA和CSNK2A1）和DNA损伤反应（DDR）调节剂（ATM）活性的互补性增加；图5C和S6）。早期抗性MV-4-11细胞表现出类似的模式，包括额外的有丝分裂检查点蛋白AURKB、AURKA和DDR蛋白ATM和ATR的活性增加，当分别考虑FGF2-和FL-衍生培养物时，其中许多也在MOLM14抗性培养中发现（图S5B-S7）。值得注意的是，在晚期耐药的MOLM14和MV4-11细胞中，这些细胞周期的改变在很大程度上被逆转，从耐药早期到晚期CDK磷酸化显著增加（图5C和S5B）。与亲本细胞相比，FGF2和FL在早期抗性细胞中参与了MAPK和PI3K信号转导，而在晚期、配体非依赖性抗性的MOLM14和MV4-11细胞中，这些信号通路在NRAS突变亚克隆扩增后更显著地增加（图2B、5C、S1C、S5B、S6和S7）。

研究人员还使用了了CausalPath，CausalPath是一种使用PathwayCommons数据库中的精选信号通路数据来推断差异蛋白质组和磷酸蛋白质组读数之间的因果关系的方法。与KSEA一致，CausalPath认为早期耐药主要表现为细胞周期进程的减少，因为早期耐药的MOLM14培养物中CDK1、CDK2、MYC和细胞周期蛋白D3信号的减少就是明显的（图5D）。早期耐药网络图还突出显示了与脂质代谢相关的蛋白质，包括CPT1A、NRF1、CAPNS1和SPAST，这与早期吉瑞替尼耐药开始的代谢重塑一致（图5D和S5C）。在获得NRAS突变后，在MOLM14和MV4-11抗性品系中，CDKs和MAPK的活性增加（反映在它们的磷酸化中）（图5E、S5D和S5E）。总而言之，早期和晚期对吉特替尼耐药的MOLM14和MV4-11细胞的蛋白质组和磷酸蛋白质组图谱独立地验证了WES、CRISPR-CAS9和代谢组分析鉴定的许多基因和途径，同时涉及到了其他信号通路。

图5早期和晚期对吉瑞替尼耐药的培养物具有不同的蛋白质组学特征，早期耐药显著降低了细胞周期蛋白活性

6、早期吉瑞替尼的耐药性依赖于AURKB对细胞周期的调控

研究人员的磷酸蛋白质组学数据强烈表明，细胞周期的改变与早期吉瑞替尼耐药性有关。因此，研究人员用碘化丙啶（PI）染色DNA含量的方法分析了MOLM14亲代和早期及晚期耐吉瑞替尼培养物的细胞周期特征。正如预期的那样，24或48小时的短期吉瑞替尼治疗基本上会停止MOLM14亲代细胞的细胞周期（S和G2/M）（图6A）。对FGF2和FL耐药的MOLM14细胞进行的细胞周期分析显示，与未经处理的亲本细胞相比，进入S期的细胞数量减少（图6A和6C），这与KSEA推断的CDK2、4和6的活性降低一致（图5C和5D）。同时，处于G2/M期的细胞数量相对没有变化，这表明细胞周期进程总体上有所下降（图6A和6C）。为进一步区分G0中活跃周期细胞和非周期细胞，用PI（x轴）和Ki67（y轴）标记细胞增殖。早期耐药培养的非周期细胞比例最高（图6B和6C）。相反，晚期抗性培养的细胞周期曲线与未经处理的亲本MOLM14相似（图6A和6C）。这些数据证实了磷酸化蛋白质组学分析所预测的细胞周期变化（图5C和5D）。

早期抗性培养中细胞周期的减慢表明了检查点分子的调节。研究人员注意到，在MOLM14和MV-4-11的耐药培养物中，极光激酶（调控细胞有丝分裂的一类重要的丝氨酸/苏氨酸激酶）都有强烈的上调，并且通过KSEA分析注意到特别是AURKB的活性显著增加。（图S5B-S7）。研究人员在FGF2和FL早期耐吉瑞替尼的MOLM14培养物中测试了一种特定的AURKB抑制剂AZD，发现这些培养物对仅对AZD特异性敏感，且是与吉瑞替尼结合的（图6D和6E；表S2）。相比之下，AURKA和AURKC的药理学抑制在早期耐药培养中表现出很少的活性，这表明早期吉瑞替尼耐药依赖于AURKB（图S8A-S8H；表S2）。为证实AURKB的特异性，发现CRISPR介导的AURKB基因敲除可增强早期耐药细胞系对吉瑞替尼的敏感性（图6F和6G），而CRISPR介导的AURKA或AURKC基因失活却不能增强早期对吉瑞替尼的敏感性（图S8I–S8L）。作为AZD对AURKB特异性的进一步确认，CRISPR-Cas9对AURKB的基因缺失使其对AZD的进一步抑制不敏感（图S8M）。

图6早期耐药培养的细胞周期较慢，抑制AURKB可使早期耐药的MOLM14细胞对吉瑞替尼重新敏感

7、早期和晚期吉瑞替尼耐药模型再现人类疾病

临床上，对吉瑞替尼的早期耐药性的特点是仅限于骨髓的低水平残留疾病，以及通过增加白血病负担和疾病复发而产生的晚期耐药性。NRAS突变是复发性/难治性AML中最常见的获得性突变，在研究人员的晚期耐药培养中，NRAS突变的扩大再次说明了这一点。为评估研究人员早期耐药培养的临床相关性，研究人员选择了12名使用吉瑞替尼治疗的患者，既有他们治疗前的样本又有他们在接受吉瑞替尼治疗1或2个月后与治疗前配对的样本。在接受吉瑞替尼治疗后，尽管百分比通常较低，大多数患者仍有通过流式细胞术检测到的白血病细胞（表S4），这也限制了分析的细胞数量。用CD33+和CD34+珠子来选择富集AML细胞，并用由来自MOLM14和MV-4-11的优先蛋白质组成的靶向蛋白质panel进行分析（图5和S5）。由于蛋白质产量低，删除了一个患者样本。PCA表明，其余11个治疗前样本和早期耐药样本之间存在明显差异（图7A）。在用靶向蛋白质组学研究的种蛋白质中，52种蛋白质在用吉瑞替尼治疗后显著改变（q0.05）。无监督的层次聚类分析显示三个主要信号传导过程发生了显著改变：（1）调节细胞周期进程的蛋白质丰度显著降低，包括CDK1、CDK2、CDK4和CDK9；（2）MAPK信号蛋白的增加；（3）参与脂肪酸代谢的蛋白质增加（图7B和7C）。来自相应患者样本（7例）的骨髓基质在吉瑞替尼治疗后也显示FGF2mRNA表达显著增加（p0.）（图7D），与先前的结果一致（Traer等人，）。

鉴于早期吉瑞替尼耐药培养物和患者样本之间蛋白质组特征的相似性，研究人员测试了AURKB抑制是否能使患者AML细胞在体外对吉瑞替尼重新敏感。吉瑞替尼治疗前后四名患者的成对原代AML细胞被接种在HS-5基质细胞条件培养基中，以模拟骨髓微环境，并单独或联合使用吉瑞替尼和AZD治疗。在HS-5条件培养基中，预处理样品对吉瑞替尼或AZD相对不敏感。然而，早期耐药样本对吉瑞替尼和AZD的组合极为敏感（图7E），反映了早期耐药细胞培养的结果（图6D和6E）。对BeatAML数据集中大量原代AML样本的检查（例）显示，具有FLT3-ITD突变的AML细胞对AZD明显更敏感，而具有NRAS突变的AML样本往往不敏感。进一步证明AZD在NRAS突变扩大之前的疾病治疗中更有效（图7F）。

图7原发早期耐药AML样本的靶向蛋白质组学显示，细胞周期蛋白减少，脂质代谢蛋白增加，MAPK信号蛋白改变；体外治疗证实了AURKB在早期耐药中的易损性

Discussion

导致组成性活性受体酪氨酸激酶的基因改变通常会促进对这些癌蛋白及其信号通路的依赖，这一过程被称为“癌基因成瘾”。这种信号成瘾可以用小分子激酶抑制剂作为靶点。然而，对于大多数癌症而言，残留细胞持续存在，残留细胞是最终耐药克隆和疾病复发的诱因。干扰激酶抑制或激活旁道的突变在晚期耐药细胞中很常见。相比之下，由于早期耐药细胞的缺乏及其相对缓慢的生长速度，对初始疾病持续性的机制还不太清楚。最近对其他恶性肿瘤的研究表明，“耐药持久性”细胞亚群本质上对癌症药物更有抵抗力。虽然术语persistent意味着细胞只是处于静止状态，但研究人员的数据显示情况并非如此。这些细胞独特地依赖于AML微环境中的生存因子，生长较慢，并依赖动态代谢变化生存。因此，研究人员更倾向于使用earlyresistance来描述该过程。早期耐药细胞的适应性使它们有时间进化机制，摆脱对骨髓微环境的依赖；然而，在这一过程中，他们也获得了新的敏感性。针对早期耐药细胞的易损性是提高对激酶抑制剂反应持久性的一个有吸引力的策略。

大多数耐药细胞系模型重现的是复发时发现的肿瘤内在突变，而不是定义患者早期耐药性的外在介导的非遗传性适应。通过将AML细胞暴露于微环境配体FGF2和FL中，研究人员创建了一个两步模型，该模型捕捉到早期耐药的独特特征（图7B和7C），以及向内在晚期耐药的演变过程（图1B）。这种方法使研究人员不仅可以把早期和晚期吉瑞替尼耐药的特征看作是离散的事件，而且还可以看作是一个连续的进化过程。骨髓微环境表达了许多影响白血病细胞的生长因子和细胞因子，但FGF2（图7D）和FL的表达水平在治疗期间增加，这表明这些配体在对FLT3i的早期抗性过程中受到调控。FGF2和FL再现了FLT3AML中两种基本的耐药模式。和其他激酶驱动的恶性肿瘤中一样，FGF2在AML激活FGFR1和下游MAPK/AKT信号通路，这是一个经典的辅助耐药信号通路。相反，FL导致FLT3的部分再激活。尽管两种配体的耐药机制不同，但它们都集中在MAPK和AKT途径上，这两种途径对FLT3i耐药至关重要，它们反映了体内配体与受体的相互作用，即使它们不能并捕捉到体内骨髓微环境的全部复杂性。

研究人员的模型表明，尽管早期耐药细胞中存在低水平的NRAS突变，但对吉瑞替尼的初始耐药并不依赖于NRAS突变（图2C），强调非突变、代谢和表型适应对早期耐药的存活更为关键。相反，在AML患者复发时，通常在大约6个月的治疗后才发现NRAS突变，研究人员在相似的时间框架内观察到晚期耐药培养中NRAS突变的扩展（图2A-2C和S1B）。除NRAS突变外，研究人员还发现FLT3突变会干扰吉瑞替尼结合（特别是FLT3FL，图2A），这也在一小部分接受吉瑞替尼治疗的AML复发患者中被发现。总之，吉瑞替尼耐药性遵循一种可预测的、非随机的非突变早期耐药模式，最终导致内在突变和晚期耐药的扩大。

尽管研究人员在早期耐药培养物恢复生长后（约30天，图1B）对其进行了大量的机理研究，但恢复配体依赖性生长前的事件仍不清楚。研究人员用蛋白质组学方法对吉特替尼作用了30min和3h后的MOLM14亲本细胞进行研究，以评估由吉瑞替尼±FGF2/FL介导的急性变化（图S9和S10）。KSEA显示单独使用吉瑞替尼可显著上调DNA损伤蛋白（ATM和ATR）和生理代谢（mTOR），显著下调细胞周期蛋白（CDK1、CDK2、AURKA和AURKB）。由KSEA鉴定的大多数蛋白质在添加配体后保持不变；然而，AURKA、AURKB、ATM和ATR没有显著下调，这表明配体抑制了这些途径。研究人员进一步通过RNA测序评估了急性（48小时）用吉瑞替尼±FGF2/FL治疗后以及早期耐药（第30天）时MOLM14细胞的转录变化。反应组途径分析确定，急性吉瑞替尼治疗可诱导细胞周期停滞、DDR上调、自噬、凋亡和中枢能量代谢停止（图S10）。在48小时时，添加FGF2或FL对这些途径没有明显影响，但到大约第30天时，细胞能够克服细胞周期阻滞，尽管它们的循环速度仍然比亲代和晚期耐药细胞慢（图5C、6A–6C、S5B、S9、S11和S12）。同样，原代AML细胞也会减少早期耐药的细胞周期蛋白（图7B和7C）。因此，研究人员假设少量具有保留的AURKB活性和代谢改变的细胞（图4）能够逃避由吉瑞替尼诱导的初始细胞周期停滞，并在早期抗性中恢复生长。AZD对AURKB活性的抑制可恢复早期耐药细胞对吉瑞替尼的敏感性，在早期耐药原发性患者样本中更为显著（图6D–6G和7E）。

为了评估AURKB在早期耐药中的调节是否是吉瑞替尼所独有的，或者是对FLT3抑制剂耐药的保守机制，研究人员还对早期和晚期对奎扎替尼耐药的MOLM14培养物进行了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学研究。奎扎替尼是另外一种有效的FLT3i，但与吉瑞替尼相比，晚期耐药通常由FLT3-TKD突变驱动，这会导致FLT3信号的恢复。与早期耐吉瑞替尼的培养物类似，早期耐奎扎替尼的培养物基本上仍然依赖配体，且不会发生耐药突变。KSEA分析显示，奎扎替尼耐药早期有显著的CDC7活性（图S13A）。CDC7是AURKB上游的另一种细胞周期调节器。CDC7或AURKB的CRISPR-Cas9缺失能够使早期耐药培养物对其各自的FLT3i重新敏感（图S13B–S13I），从而证明CDC7/AURKB是一种保守的FLT3抑制耐药机制。此外，极光激酶也与肺癌对EGFR抑制剂的耐药性有关，因此，Aurora激酶可能是固体和液体肿瘤早期耐药的共同途径。

与亲代MOLM14细胞相比，随着细胞周期的减慢，早期抗吉瑞替尼细胞也进化出独特的代谢特征（图4B-4E）。以前对奎扎替尼的研究表明，奎扎替尼对AML细胞的代谢有直接影响，研究人员确认这也适用于吉瑞替尼（表S3）。FGF2或FL不能恢复治疗前的代谢表型，但显示出明显的适应性，这表明微环境对代谢的影响（图4）。FGF2晚期培养物显示出改变的鞘脂代谢，而FL晚期培养物优先利用肉碱/脂肪酸代谢（图4D-4I）。虽然这些特殊模式在早期耐药中存在，但随着晚期耐药中NRAS突变的扩大，它们变得更加明显，这表明特定亚群可能具有独特的代谢，在缺乏配体的情况下提供了选择优势。需要进一步的单细胞研究来检查代谢异质性，并探索何时以及如何发生这种重组；然而，主要样本的靶向蛋白质组学表明，在体内1-2个月后可以检测到代谢的变化（图7B和7C），这与研究人员的体外模型一致。与研究人员的研究一致的是，以前曾报道过AML中代谢与耐药性的改变。特别是，白血病干细胞主要依赖氧化磷酸化，但能量来源在抗性设置中有所不同。研究人员研究中的类似发现揭示了一种独特代谢的演变，这种代谢随着对吉瑞替尼的耐药性而发展。

总之，研究人员的逐步、非随机的吉瑞替尼耐药性模型概括了临床耐药性，并为解释耐药性的演变提供了一个新的框架。从研究人员的工作中可以提出一些克服耐药性的治疗策略。由于MEK和PI3K抑制剂部分恢复了吉瑞替尼的疗效（图3f-3J），靶向给予晚期吉瑞替尼耐药性的NRAS突变为联合治疗提供了一种潜在的方法；这些联合疗法已被提出用于急性髓细胞白血病和其他癌症。然而，并非所有接受吉瑞替尼治疗的患者都会发生RAS突变，并且尚不清楚添加这些抑制剂是否会阻止RAS突变的扩大或促使早期耐药细胞采用替代耐药机制。因此，针对早期抗药性的独特敏感性可能更有效。虽然针对早期耐药细胞的代谢依赖性很有吸引力，但在研究人员的模型和其他模型中看到的可塑性表明，只针对一个代谢脆弱性可能是不够的。缺乏有效的代谢小分子抑制剂是另一个限制因素，因为研究人员测试了许多代谢抑制剂，但它们的浓度往往非常高（数据未显示）。相反，无论它们的独特代谢特征如何，研究人员的早期耐药培养和原代早期耐药AML细胞对AZD和吉瑞替尼（图6D和6E以及图7E）的组合都非常敏感。因此，利用这种早期耐药性的独特易损可能会阻碍侧向耐药性的多种机制，并提高对吉瑞替尼的耐受性。

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